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L'identificazione di mutazioni di regola si articola nelle seguenti procedure:
1. estrazione del DNA
2. amplificazione con primers intronici che fiancheggiano ciascun esone del gene
3. messa a punto delle condizioni di analisi al DHPLC mediante procedura lunga
4. analisi di tutti i campioni al DHPLC con procedura breve
5. identificazione dei DNA che presentano un profilo anomalo al DHPLC
6. sequenziamento per determinare la natura delle variazioni di sequenza
7. verifica che ciascuna variazione sia assente in banca dati
8. verifica che ciascuna variazione sia assente nei controlli
Nomenclatura per la descrizione delle variazioni di sequenza del DNA
I nucleotidi sono designati dalle basi in maiuscolo: A (adenina), C (citosina), G (guanina), T (timina)
Numerazione dei nucleotidi
Nucleotidi del cDNA
• Il nucleotide +1 è la A dell’ ATG-codone di inizio della traduzione
• Il nucleotide che precede al 5' l’ATG-codone di inizio della traduzione è denominato -1; non esiste una base 0
• Il nucleotide che segue al 3' il codone di terminazione è denominato *1
Nucleotidi intronici fiancheggianti
• inizio dell’introne: il numero dell’ultimo nucleotide dell’esone che precede, il segno + e la posizione nell’introne, ad esempio 77+1G, 77+2T, oppure quando il numero dell’esone è noto ed univoco IVS1+1G, IVS1+2T
• fine dell’introne: il numero del primo nucleotide del esone seguente, il segno – e la posizione a monte dell’esone, ad esempio 78-2A, 78-1G, oppure quando il numero dell’esone è noto ed univoco, IVS1-2A, IVS1-2G
Descrizione dei cambiamenti nucleotidici
• le sostituzioni sono indicate dal carattere “>”. Ad esempio, 76A>C indica che in posizione 76 un’adenina è sostituita da una citosina
88+1G>T (oppure IVS2+1G>T) indica che una guanina è sostituita da una timina in posizione +1 dell’introne 2, posizionato tra i nucleotidi 88 e 89 del cDNA
89-2A>C (oppure IVS2-2A>C) indica che un’adenina è sostituita da una citosina in posizione -2 dell’introne 2, posizionato tra i nucleotidi 88 e 89 del cDNA
• Le delezioni sono indicate dalla posizione dei nucleotidi fiancheggianti accompagnati dalla sigla “del”.
76_78del (oppure 76_78delACT) indica una delezione ACT dai nucleotidi 76 a 78
82_83del (oppure 82_83delTG) indica una delezione TG della sequenza: ACTTTGTGCC (A è il nucleotide 76) che diventa ACTTTGCC
• Le inserzioni sono indicate dalla posizione dei nucleotidi fiancheggianti accompagnati dalla sigla “ins”
76_77insT indica che una timina è inserita tra I nucletidi 76 e 77
NOTA: come separatore il carattere "^" è talvolta usato ma è da evitare (83^84insTG)
• La variabilità di una ripetizione di basi (short tandem repeat) come nella sequenza ACTGTGTGTGTGCC (A è il nt 1991), è indicata come 1993(TG)4-8 con il nucleotide 1993 che contiene il primo dinucleotide TG che si trova ripetuto da 4 a 8 volte nella popolazione.
• Le inserzioni/deletioni (indels) sono descritte come una delezione seguita da un inserzione dopo il nucleotide colpito
112_117delAGGTCAinsTG (oppure 112_117delinsTG o 112_117>TG) indica la sostituzione dei nucleotidi da 112 a 117 (AGGTCA) con TG
• Le duplicazioni sono indicate con la posizione della sequenza duplicata seguita dalla sigla “dup” 77_79dupCTG indica che i nucleotidi da 77 a 79 sono duplicati
• Le inversioni sono indicate dalla posizione dei nucleotidi fiancheggianti seguita dalla sigla “inv”.
203_506inv (oppure 203_506inv304) indica che un blocco di 304 nucleotidi tra le posizioni 203 e 506 è invertito
Alleli
• Le variazioni nucleotidiche in alleli diversi (come nelle patologie autosomiche recessive) sono indicati come "[cambiamento allele 1] + [cambiamento allele 2]"
[76A>C] + [76A>C] indica una sostituzione di un’adenica con una citosina in posizione 76 presente in omozigosi
[76A>C] + [?]indica una sostituzione di un’adenica con una citosina in posizione 76 presente in eterozigosi, con la variazione del allele sconosciuta
• Più variazioni in uno stesso allele sono indicate all’interno della stessa parentesi "[primo cambiamento; secondo cambiamento; terzo..ecc.]"
[76A>C; 83G>C] indica una sostituzione di un’adenica con una citosina in posizione 76 e, sempre sullo stesso allele una guanina sostituita da una citosina in posizione 83.
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